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數(shù)字PCR的運(yùn)行階段

更新時(shí)間:2022-12-16

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  數(shù)字PCR是一種核酸檢測和定量的新方法。同傳統(tǒng)PCR以及qPCR相比,增加了一步分液的操作,將幾十微升的已經(jīng)配好的包含有引物、模板、buffer、酶等組分的PCR反應(yīng)體系分隔成了眾多微小的、獨(dú)立的反應(yīng)體系,這樣能夠直接數(shù)出DNA分子的個(gè)數(shù),對起始樣品定量,通過將一個(gè)樣本分成幾萬到幾百萬份,分配到不同的反應(yīng)單元,每個(gè)單元包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)分子( DNA 模板) ,在每個(gè)反應(yīng)單元中分別對目標(biāo)分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增結(jié)束后對各個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。如下圖:
 

數(shù)字PCR

 

  PCR 運(yùn)行可以分為三個(gè)階段:
 
  指數(shù)期
 
  每個(gè)循環(huán)積聚的產(chǎn)物準(zhǔn)確加倍(假定 100% 反應(yīng)效率)。該反應(yīng)具有高度特異性和準(zhǔn)確度。出現(xiàn)指數(shù)式擴(kuò)增,因?yàn)樗性噭┚迈r可用,反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)推動(dòng)反應(yīng)有利于擴(kuò)增子加倍。
 
  線性期(高變異性)
 
  隨著反應(yīng)繼續(xù),一些試劑因擴(kuò)增而被消耗。反應(yīng)開始減緩,并且每個(gè)循環(huán)的 PCR 產(chǎn)物不再加倍。
 
  平臺(tái)期(終點(diǎn):使用傳統(tǒng)方法進(jìn)行凝膠檢測)
 
  反應(yīng)停止,不再產(chǎn)生更多產(chǎn)物,并且如果放置時(shí)間夠長,PCR 產(chǎn)物將開始降解。因?yàn)槊總€(gè)樣品具有不同的反應(yīng)動(dòng)力學(xué),所以每支試管或每個(gè)反應(yīng)將在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)入平臺(tái)期。在平臺(tái)期可以看到這些差異。在平臺(tái)期內(nèi),傳統(tǒng) PCR 進(jìn)行測量,又稱為終點(diǎn)檢測。
 
  數(shù)字PCR檢測的是游離DNA,采血管為游離DNA管,采樣5-10ml。檢測過程包括核酸提取、芯片制備、PCR擴(kuò)增、芯片閱讀、結(jié)果分析,實(shí)現(xiàn)全程基本自動(dòng)化、封閉式操作,避免污染。無需培養(yǎng),節(jié)省時(shí)間;高靈敏度,提高檢出率;多色熒光檢測,一管血可檢測23個(gè)靶標(biāo),節(jié)省寶貴樣本,幫助解決“檢出率低”和“檢測周期長”兩大痛點(diǎn),達(dá)到早期診斷、療效監(jiān)測的目的。
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